ELISA操作常見(jiàn)問(wèn)題和解決方法

更新時(shí)間：2015-09-23

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ELISA操作常見(jiàn)問(wèn)題和解決方法

ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，是目前廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體檢測(cè)的方法，主要有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。ELISA操作步驟看似簡(jiǎn)單，整個(gè)測(cè)定過(guò)程中卻有諸多影響因素，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可能與實(shí)際結(jié)果偏差較大。為幫助大家分析實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題，我們將常見(jiàn)問(wèn)題的可能原因和解決方法歸納總結(jié)于下表：

問(wèn)題一：高背景或陰性對(duì)照值偏高

可能原因	建議
陰性對(duì)照孔被陽(yáng)性對(duì)照或樣品污染	洗滌時(shí)，勿將洗液溢出孔外。
洗滌不充分	確保在洗滌時(shí)每個(gè)孔都充滿了液體，確保將殘余液體從孔中移除。
酶結(jié)合物過(guò)濃	請(qǐng)檢查酶結(jié)合物是否按說(shuō)明書規(guī)定稀釋
孵育溫度過(guò)高	檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定
底物在使用前曝光	應(yīng)保存在暗處，避光。
讀板前停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)	加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù)

問(wèn)題二：陽(yáng)性對(duì)照值偏低或低吸光度

可能原因	建議
蒸發(fā)	各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板。
溫度不均勻	校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板。

問(wèn)題三：邊緣效應(yīng)

可能原因	建議
蒸發(fā)	各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板
溫度不均勻	校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板

問(wèn)題四：標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳

可能原因	建議
倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未混勻	稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的每一步均需混勻
過(guò)早稀釋	標(biāo)準(zhǔn)品在快要使用時(shí)稀釋
加入的體積不正確	使用校準(zhǔn)過(guò)的移液器，快速、等量的將標(biāo)準(zhǔn)品分配到各個(gè)微孔中

問(wèn)題五：標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣本無(wú)檢測(cè)信號(hào)

可能原因	建議
樣本中無(wú)檢測(cè)物或檢測(cè)物含量極低	設(shè)置內(nèi)參，重新實(shí)驗(yàn)
樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測(cè)	作適當(dāng)稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾，或作系列稀釋，檢測(cè)回收率。
樣本中檢測(cè)物濃度過(guò)高，Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值	適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本，檢測(cè)物濃度盡量在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)。

問(wèn)題六：重復(fù)性較差

可能原因	建議
微孔中有氣泡	用針尖挑破氣泡
試劑未混勻	確保充分混勻試劑
樣本中有雜質(zhì)或沉淀物	使用前離心
微孔包被面被吸頭劃破	加液時(shí)小心操作
使用用過(guò)的封板膠紙	每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔